Játszódik a 19. század elején, Salzburgban 

Első felvonás: Stankar gróf kastélya 

Stiffelio lelkipásztor hosszas távollét után hazatér és elmeséli, hogy egy tutajos átadott neki egy levéltárcát, amelyet az a férfi vesztett el, aki szerelmi kalandja után az ablakon ugrott ki. Stiffelio a keresztény baráti szeretet nevében fátylat borít az esetre és megsemmisíti a bizonyítékot. Nem tudja, hogy felesége, Lina házasságtörését evvel bizonyíthatta volna. Lina apja azonban gyanakodni kezd. Amikor megfigyeli, hogy Raffaele egy könyvbe rejtett cédulán üzenetet küld lányának, tisztán lát, ám a család tisztességének megőrzése érdekében felszólítja Linát, hogy hallgasson. A cédulát a lelkipásztor is látta, ő azonban Federicóra, Lina unokatestvérére gyanakszik.  

Második felvonás: temető egy régi templom mellett 

A kétségbeesett Lina anyja sírjánál keres oltalmat. Raffaele itt is ostromolja szerelmével, de Lina elutasítja, hiszen csupán egyetlen gyenge percében engedett neki. Az öreg Stankar párbajra hívja ki Raffaelét. A mit sem sejtő Stiffelio megpróbálja őket Isten nevével szétválasztani, de közben megtudja a házasságtörés tényét. A keresztényi megbocsátás és az őrjöngő féltékenység közt őrlődik. 

Harmadik felvonás  

Első kép: előszoba a kastélyban 

Stankar értesül róla, hogy Raffaele meg akar szökni Linával. Stiffelio magyarázatot kér feleségétől, és kényszeríti Raffaelét, hogy észrevétlenül legyen tanúja a beszélgetésnek. Amikor a lelkipásztor Lina elé teszi a válási papírt, Lina kéri, hogy nem mint a férjének, hanem mint Isten emberének tehessen vallomást. Elmondja, hogy csak egyetlen pillanatra lett úrrá rajta a gyengeség, de változatlanul a férjét szereti. Stankar meggondolatlan hevében, hogy a család becsületét megmentse, megöli a hallgatózó Raffaelét. 

Második kép: a templomban 

Mélységes zavarodottsága ellenére Stiffeliónak el kell látnia lelkipásztori feladatait. Véletlenszerűen fellapozza a Bibliát, és éppen Jézus és a házasságtörő asszony története kerül a szeme elé. Prédikációja követi a Szentírás szövegét, de egyszersmind kifejezi az ő személyes megbocsátását is.